Дискуссии

« вернуться к списку

версия для печати

Микроскоп стал наноскопом

Фото с сайта www.polit.ru Нобелевская премия в области химии этого года присуждена Эрику Бетцигу, Штефану Хеллю и Уильяму Мернеру за развитие флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. Их имена не упоминались в последних прогнозах аналитиков, но заслуженность награды и огромное значение их работы бесспорны.

Ученые, внесшие вклад в развитие микроскопической техники, не в первый раз обращают на себя внимание Нобелевского комитета. Еще в 1925 году премию по химии получил Рихард Адольф Зигмонди за исследование коллоидных растворов. Одним из главных достижений Зигмонди, сыгравшим важную роль и в его открытиях, и в дальнейшем развитии коллоидной химии, было изобретение ультрамикроскопа и иммерсионного микроскопа. В 1953 году премию, на этот раз в области физики, получил голландец Фриц Цернике, изобретатель фазово-контрастного микроскопа. В 1982 году Аарон Клуг за разработку метода кристаллографической электронной микроскопии получил премию по химии. Особенно удачным для изобретателей новых типов микроскопов оказался 1986 году. Тогда премию по физике получили Эрнст Руска – создатель первого электронного микроскопа, а также Герд Бинниг и Генрих Рорер – изобретатели сканирующего туннельного микроскопа. В том же году, но в области химии, Нобелевскую премию получили Аарон

Создавая новые микроскопы, исследователи стремятся увидеть все более мелкие объекты, и очень скоро на их пути встает преграда, которая кажется непреодолимой. Это дифракционный предел, или предел Аббе, названый в честь немецкого оптика Эрнста Аббе, открывшего это явление еще в 1873 году. Аббе установил, что минимальный размер пятна, которое мы можем получить, фокусируя электромагнитное излучение, определяется формулой λ/2n, где λ – длина электромагнитной волны в вакууме, n – показатель преломления среды. Микроскоп не поможет нам разглядеть объекты, размер которых меньше этой величины. Длина волны электронов меньше, чем у фотонов, поэтому возможности электронных микроскопов больше, но и перед ними неумолимо встает дифракционный предел.

Мы однажды рассказывали, как предел Аббе преодолевается при помощи принципиально иного метода – атомно-силовой микроскопии, никакого отношения к оптике не имеющего. Сегодняшние лауреаты подошли к решению этой проблемы иначе.

Все трое ученых работали в области флуоресцентной микроскопии, основанной на свечении атомов и молекул изучаемого образца в ответ на поглощенное излучение. Во флуоресцентном микроскопе объект освещается светом определенной длины волны, который поглощается молекулами, заставляя их излучать свет более длинных волн (т.е., другого цвета, чем поглощенный). Этот свет регистрируется детектором. Сам по себе метод флуоресцентной микроскопии не способен преодолеть предел Аббе.

В 1993 году Штефан Хелль, работавший в то время в Финляндии, в Университете Турку, придумал, как усовершенствовать флуоресцентный микроскоп. Его метод известен сейчас под названием STED-микроскопия (Stimulated Emission Depletion Microscopy "микроскопия на основе подавления спонтанного испускания"). Штефан Хелль предложил использовать два лазера, направленных на образец. Импульс первого лазера вызывает флуоресценцию молекул, а импульс второго – гасит эту флуоресценцию у молекул, находящихся на краях изучаемой области, а значит, в центре получается изображение с большим разрешением. В дальнейшем, сдвигая изучаемую область, можно получить изображение всего объекта с превосходящим предел Аббе разрешением.

Статья Штефана Хелля, опубликованная в 1994 году в журнале Optics Letters, обратила на себя внимание, и ему предложили работу в Институте биофизической химии Общества Макса Планка в Геттингене, где он мог бы реализовать свои теоретические предположения на практике. Ученый сделал это к 1999 году, построив STED-микроскоп. В 2000 году он опубликовал изображения бактерии Escherichia coli с невиданным ранее разрешением.

Другое направление независимо развивали американские исследователи Эрик Бетциг и Уильям Эско Мернер. Последнего с детства зовут по инициалам W. E., чтобы отличать от отца и деда, также Уильямов Мернеров. Эти ученые разработали методы одномолекулярной флуоресцентной микроскопии (single-molecule fluorescence microscopy).

Обычно при изучении флуоресценции, в частности при использовании этого явления в микроскопии, мы имеем дела с поглощением и испусканием излучения сразу множеством молекул. В 1986 году Мернер сумел впервые измерить поглощение излучения одной единственной молекулой. Через восемь лет Мернер сделал следующий шаг в своих исследованиях, занявшись изучением зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP, о роли этого белка в современной биологии мы уже однажды рассказывали). Мернер обнаружил, что флуоресценцию в одном варианте GFP можно "включать" и "выключать" по желанию. Когда белок поглощает свет с длиной волны 488 нанометров, флуоресценция начинается, но спустя некоторое время исчезает. И, независимо от количества света, направляемого на белок, ответного излучения не возникает. Однако, если использовать свет с длиной волны 405 нанометров, то молекула белка снова начинает флуоресцировать.

Мернер распределил эти молекулы GFT в геле так, чтобы расстояние между каждой отдельной молекулой было больше, чем дифракционный предел Аббе. Из-за того, что они были рассеяны столь редко, микроскоп оказался в состоянии регистрировать свечение отдельных молекул. О своей работе Мернер рассказал в журнале Nature в 1997 году.

Полученные Мернером результаты помогли Эрику Бетцигу, работавшему в области ближнепольной оптической микроскопии (near-field microscopy). Он догадался, что если микроскоп будет регистрировать излучение молекул с определенной длинной волны, рассеянных в образце не ближе друг к другу, чем 0,2 мкм (приблизительная величина предела Аббе), то положение может быть определено с высокой точностью. Если же в образце будут молекулы с разными свойствами, например, дающие при флуоресценции ответное излучение с разной длиной волны, то можно сделать отдельные картины распределения каждого "вида" молекул, а потом, накладывая их друг на друга, в полным изображении добиться разрешения, превышающего предел Аббе. Молекулы будут различимы, даже если расстояние между ними составит всего несколько нанометров.

Эти идеи Бетциг высказал в своей публикации в журнале Optics Letters в 1995 году, но реализовать их казалось невозможным, так как не находилось молекул с нужными свойствами. Бетциг даже на некоторое время оставил академическую деятельность и стал работать в компании своего отца Ann Arbor Machine Company, занятой прикладными научно-исследовательскими конструкторскими разработками. Он продолжал следить за публикациями и наконец узнал об исследованиях GFP. Вернувшись к работе в области микроскопии, к 2005 году Бетциг, экспериментировавший с разными видами флуоресцентных белков, разработал метод преодоления предела Аббе. Только молекулы не испускали свет разного цвета, как он предполагал в 1990-х, а начинали светиться в разные моменты времени. Этого оказалось достаточным, чтобы получить набор изображений, из которых сложится одно – уже со сверхвысоким разрешением. Метод получил название микроскопия локализованной фотоактивации (photoactivated localization microscopy).

Сейчас благодаря одномолекулярной флуоресцентной спектороскопии ученые могут наблюдать в реальном времени за процессами сворачивания белков и ДНК и определять положение отдельных молекул в клетке с точностью до нескольких десятков нанометров.

Аналог метода Хелля, где используется два лазерных луча, уже нашел прикладное применение при создании оптических дисков для записи информации большой плотности (на стандартном диске умещается 5 петабайт, что соответствует, например, видеозаписи продолжительностью около 10 лет).

Сами лауреаты сейчас применяют созданные ими методы в новых исследованиях. Штефан Хелль заглянул внутрь живых нейронов, чтобы изучить на молекулярном уровне строение синапсов мозга. Мернер занят исследованиями белков, играющих роль в развитии синдрома Хантингтона. Эрик Бетциг исследует деление эмбриональных клеток. После работ Хелля, Мернера и Бетцига оптическая микроскопия преодолела дифракционный предел Аббе и превратилась в "наноскопию".

Максим Руссо

источник: Полит.Ру

Последние материалы раздела

• 30 декабря 2016
  Диссертация Мединского как летучий голландец
• 30 декабря 2016
  Работа есть — денег нет
• 29 декабря 2016
  "Основной удар придется на московские и петербургские институты"
• 29 декабря 2016
  Советник Путина: Россию могут отключить от интернета
• 28 декабря 2016
  Драйверы инноваций

Обсуждение

Добавить комментарий

Обсуждение материалов доступно только после регистрации.

« к началу страницы